了解遠(yuǎn)場(chǎng)校正物鏡分辨能力與放大率

在光學(xué)工業(yè)中，顯微鏡一般用于機(jī)器視覺(jué)和生命科學(xué)，或生物和應(yīng)用上。機(jī)器視覺(jué)應(yīng)用可支持半導(dǎo)體、電子產(chǎn)品、裝配，以及制造市場(chǎng)等。而生命科學(xué)應(yīng)用則可用于以不同的物鏡放大率，來(lái)觀察細(xì)胞或生物樣本。若要了解分辨能力、放大率和生命科學(xué)其他一般的物鏡規(guī)格之間的相互作用，那就必須考慮到無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡如何以5x、10X、20X和50X的放大率對(duì)皮膚細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行成像。

以下章節(jié)中的4個(gè)詳細(xì)應(yīng)用范例使用了愛(ài)特蒙特光學(xué)的無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡。 其中，Mitutoyo物鏡更可進(jìn)行替換。盡管Mitutoyo物鏡與機(jī)器視覺(jué)以及工業(yè)檢測(cè)相同，但它們卻可在光線偏低的環(huán)境里，以及那些于細(xì)胞和微型檢測(cè)的應(yīng)用中，發(fā)揮出的效果。

物鏡主要術(shù)語(yǔ)

不論放大率為多少，無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡都能很好地進(jìn)行成像。它們非常適用于那些要求高度以及在把濾光片、分光鏡、棱鏡和同軸照明組件加入到光路當(dāng)中時(shí)具有模塊化功能的應(yīng)用。但是，使用無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡時(shí)，必須在以下幾個(gè)方面進(jìn)行權(quán)衡：

1）較高的放大率可產(chǎn)生較高的數(shù)值孔徑，但工作距離卻會(huì)因此變短，特定視場(chǎng)范圍則變得更小。

2）較低的放大率可產(chǎn)生較低的數(shù)值孔徑，但工作距離卻會(huì)因此變長(zhǎng)，特定視場(chǎng)范圍則變得更大。

3）分辨率由放大率所控制，因此兩者將會(huì)相對(duì)增加。

放大率、數(shù)值孔徑、工作距離和分辨率皆與無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡息息相關(guān)。放大率是通過(guò)以物鏡焦距除以管透鏡焦距而取得的。數(shù)值孔徑(NA)則是入射瞳孔直徑焦距的一項(xiàng)功能，它可影響進(jìn)入到無(wú)限遠(yuǎn)校正系統(tǒng)的光量。工作距離(WD)由物鏡光路的齊焦距離所決定；它是正面光學(xué)元件與受檢測(cè)物體之間的距離。而分辨能力則是難以清楚解釋的規(guī)格。由于難以在特定放大率下觀察實(shí)物在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的情況，并將分辨能力量化，因此好的方法便是查閱以下章節(jié)中的應(yīng)用范例。有關(guān)物鏡主要術(shù)語(yǔ)的其他信息，請(qǐng)參閱“了解顯微鏡與物鏡”。

應(yīng)用范例

遠(yuǎn)場(chǎng)校正物鏡系統(tǒng)應(yīng)用非常廣泛。就生物應(yīng)用而言，為普遍的便是熒光顯微鏡。其中包括基本的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，乃具有更精密的共焦系統(tǒng)與多光子的熒光系統(tǒng)。為復(fù)雜的熒光系統(tǒng)擁有高放大率、精密機(jī)械、高質(zhì)量的濾光片以及*的光源，例如激光。而較為簡(jiǎn)單的系統(tǒng)則使用一般的寬帶光源、基本的濾光片、簡(jiǎn)單的機(jī)械，以及按受檢測(cè)樣本而定的放大率。

低放大率的皮膚細(xì)胞培養(yǎng)成像

遠(yuǎn)場(chǎng)校正物鏡必須根據(jù)幾條守則，并按被測(cè)標(biāo)本來(lái)作出選擇。一般上，細(xì)胞的大小為10μm。許多低放大率和分辨率的物鏡都適用于細(xì)胞群的成像。如果需要區(qū)分細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的組成部分，譬如線粒體、核糖體或細(xì)胞核，則1μm或以下的分辨率為理想。

在圖1-4中，所用于檢測(cè)的樣本為具有三色染色的“三維皮膚細(xì)胞培養(yǎng)模型”。此樣本由位于美國(guó)北卡羅來(lái)納三角研究園(Research Triangle Park)的Zen-Bio所培養(yǎng)與制備。在圖1中，可清楚看 到細(xì)胞成分被細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所包圍。細(xì)胞外基質(zhì)可將組織集合起來(lái)。它的內(nèi)部具有間質(zhì)性基質(zhì)和基底膜，用于存貯多糖和纖維蛋白，以作為對(duì)抗外壓的壓縮緩沖。在基底膜里存有被上皮細(xì)胞間隔，層層相疊的膜片。要清楚看到多糖凝膠和上皮細(xì)胞，好的方法就是使用高放大率的無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡。藍(lán)色的部分是組織基質(zhì)，而紫色的部分則是細(xì)胞和細(xì)胞膜。每一個(gè)細(xì)胞中都有一個(gè)含有白色和部分紅色的小區(qū)域，標(biāo)示著密集的細(xì)胞間物質(zhì)，例如線粒體及細(xì)胞核。

圖1由#59-876 5X M Plan Apo物鏡采集而成。此無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡具有0.14的數(shù)值孔徑、1.28mm x 0.96mm特定視場(chǎng)范圍的½"傳感器，以及2μm的分辨能力。由于人體細(xì)胞的大小通常為10μm 左右，因此，#59-876物鏡的規(guī)格是用于觀察人體細(xì)胞的理想選擇。

圖1：在#59-876物鏡及5X放大率下的組織樣本三色染色

圖2由#59-877 10X M Plan Apo物鏡采集而成。它具有0.28的數(shù)值孔徑、0.64mm x 0.48mm特定視場(chǎng)范圍的½"傳感器，以及1μm的分辨能力。在這一圖片中，可清楚看到ECM的堆疊與編織以及間質(zhì)結(jié)構(gòu)。此外，細(xì)胞膜也清晰可見(jiàn)。細(xì)胞的中心位置還有一些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，例如核糖體、線粒體以及一個(gè)大細(xì)胞核。

圖2： 在#59-878物鏡及10X放大率下的組織樣本三色染色

高放大率的皮膚細(xì)胞培養(yǎng)成像

圖3由#59-878 20X M PlanApo物鏡采集而成。 此無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡具有0.42的數(shù)值孔徑、 0.32mm x 0.24mm特定視場(chǎng)范圍的½"傳感器，以及0.7μm的分辨能力。圖3在的特 定視場(chǎng)范圍內(nèi)呈現(xiàn)出整個(gè)細(xì)胞。周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)得到更精細(xì)的區(qū)分，而細(xì)胞內(nèi)分子則比圖1或圖2的來(lái)得更大、更清晰。

圖3： 在#59-878物鏡及20X放大率下的組織樣本三色染色

圖4展示50X放大率的物鏡。高放大率可在不需經(jīng)過(guò)任何機(jī)械過(guò)程，或利用壓電致動(dòng)器來(lái)穩(wěn)定遠(yuǎn)場(chǎng)校正物鏡和圖像平面的情況下達(dá)到。在這一放大率下，照明器或計(jì)算機(jī)風(fēng)扇的輕微震動(dòng)可導(dǎo)致視頻饋送發(fā)生極大的晃動(dòng)并且無(wú)法對(duì)焦。圖4由#59-879 50X M Plan Apo物鏡采集而成。 它具有0.55的數(shù)值孔徑、0.128mm x 0.096mm特定視場(chǎng)范圍的½"傳感器，以及0.5μm的分辨 能力。此物鏡的焦點(diǎn)深度為0.9μm。因此，不使用適當(dāng)?shù)臋C(jī)械裝置將會(huì)導(dǎo)致對(duì)焦變得冗長(zhǎng)繁瑣。對(duì)比圖5X、10X與20X的圖像，圖4中的細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)成分顯得格外清晰及有活力。此外，細(xì)胞組成部分的大小與形狀也變得更加明顯可見(jiàn)。比較圖1（5X放大率）和圖4（50X放大率），放大率的增加顯而易見(jiàn)。分辨能力提高了4倍，而特定視場(chǎng)范圍則縮小了20倍。利用50X放大率進(jìn)行成像時(shí)，必須采用高強(qiáng)度、高對(duì)比度的光源，以提高照明度并數(shù)字化調(diào)節(jié)快門(mén)和增益。數(shù)字設(shè)置可設(shè)定為自動(dòng)的暗度和幀速率補(bǔ)償。對(duì)于組裝數(shù)字視頻顯微鏡而言，這是一項(xiàng)極為有用的功能。有關(guān)使用現(xiàn)成組件來(lái)組裝數(shù)字視頻顯微鏡的其他信息，請(qǐng)參閱“數(shù)字視頻顯微鏡的物鏡設(shè)置”。

圖4：在#59-879物鏡及50X放大率下的組織樣本三色染色

遠(yuǎn)場(chǎng)校正物鏡是用于機(jī)器視覺(jué)和生命科學(xué)應(yīng)用的理想物鏡。在進(jìn)行組織等生物樣本的成像時(shí)，對(duì)不同物鏡放大率的效果的了解是極其重要的。5X和10X的物鏡適用于觀察細(xì)胞群與細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的細(xì)微結(jié)構(gòu)。而20X和50X的物鏡則可產(chǎn)生更大的分辨率，并可用于觀察細(xì)胞內(nèi)分子。